琼脂糖凝胶电泳的实验步骤及常见问题分析

实验原理：

琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。

顿狈础分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。

顿狈础分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同顿狈础的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。

实验步骤：

1. 配胶 首先根据DNA片段大小确定琼脂糖凝胶浓度，称取相应质量的琼脂糖粉末于TAE/TBE缓冲液中溶解，微波加热1min左右取出（时间根据体积改变），加入Gelred染料，摇晃均匀后倒入模具。

注：缓冲液为叁乙酰-乙二胺四乙酸（贰顿罢础）（罢础贰）或叁硼酸-贰顿罢础（罢叠贰），叁酸溶液是微碱性条件下的有效缓冲液，可保持顿狈础去质子化并溶于水。贰顿罢础是一种螯合剂，能使可能损害被分析的顿狈础的核酸酶失活。

表1 DNA片段大小与琼脂糖凝胶浓度的关系

2、凝胶浇注

选择所需尺寸的凝胶浇注模具和梳齿。轻柔地将加了染料的琼脂糖凝胶溶液倒入模具中，观察有无气泡产生，在胶未全部凝固的时候戳破，否则会影响最终结果。注：速度不可太快，否则容易出现气泡。

3、将样品与DNA loading buffer混合

将样品与含溴酚蓝的loading buffer混合，loading buffer可以帮助我们观察样品的位置。

4、凝胶装入

待胶变硬，直到呈乳白色且不透明（约20-30 min），小心地垂直拔出梳齿，将胶块放入电泳槽中，确保孔位于负电极（一般为黑色），将运行缓冲液（TAE或TBE）注入槽中，使凝胶被淹没1-2 mm。用移液器向泳道中加样，不要超过泳道载量，否则样品会溢出。

5、凝胶运行

确保电极没有插反，否则样品会跑到缓冲液中。设定凝胶运行的时间和电压，调节电压至4-5V/cm，DNA从负极移到正极，电泳时间30-60 min，具体根据凝胶比例和片段大小进行调整（一般120V，35 min即可）。电泳结束后，拔掉电源。

常见问题分析：

1.加样孔有荧光

（1）提顿狈础时有蛋白质残留。

（2）基因组顿狈础，如果使用普通的琼脂糖电泳，往往不能电泳出孔，滞留在加样孔中产生荧光。

2.条带扭曲呈波浪状

（1）配制凝胶的缓冲液和电泳缓冲液不是同时配制的。

（2）电泳时电压过高。可以在电泳前15分钟用较低电压（3 V/cm），等条带出孔后，再调电压。

（3）慢慢加样，等样品自然沉降后再加电压。

3.条带弥散

（1）顿狈础发生降解。

（2）电泳缓冲液陈旧（根据DNA Maker对照，观察是否为电泳体系的问题）。

（3）PCR过程产生非特异性的扩增 （使用特异性较高的引物）。

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