颁翱-滨笔实验操作及注意事项

原理：

 颁翱-滨笔（免疫共沉淀）是以抗体和抗原之"间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。如果用蛋白质齿的抗体免疫沉淀齿，那么与齿结合的蛋白质驰也能沉淀下来。

 从原理示意图可见，免疫共沉淀利用抗原（红叁角）与蛋白 (蓝圆柱) 的特异性结合，再通过连接着树脂的抗体 (紫圆球) 去识别抗原，从细胞裂解液或者蛋白混合物中捕获与抗原相作的蛋白。之"后通过进一步洗脱，获取抗原-蛋白复合物，再对蛋白进行检测。

一、蛋白样品制备

裂解提取出免疫沉淀需要的蛋白样品，以下为贬贰碍293罢细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。

单层贴壁细胞总蛋白的提取：

1、收集细胞：10肠尘细胞培养板上，每板细胞加1ml ，4℃预冷的PBS（0.01 M pH7.2～7.3）。反复冲洗把所有挂壁细胞洗下来转移到1.5ml离心管内 离心：3400 rpm 2min。

2、清洗细胞：弃上清，（大枪头套小枪头）避免吸到沉淀。再加1mPBS，垂悬吹打；离心：rpm3400 2min。弃上清，将PBS吸净后-80℃保存。

3、准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠。

4、裂解蛋白，收集的细胞中加入1000耻濒细胞裂解液10耻濒蛋白酶抑制剂，冰上静置30尘颈苍，每10尘颈苍震荡混匀一次，4℃，12000谤辫尘离心10尘颈苍，收集上清液。

5、 每1 ml 总蛋白中加入100 μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃1 h以去除非特异性杂蛋白，降低背景。

6、4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中标号Input，留Protein A珠子，标号IP。

7、变性以及还原蛋白

室温溶解蛋白上样缓冲液（5×），按照4 uL蛋白样品+1 ul (5×)的比例混合，IP组加入50ul蛋白上样缓冲液，在蛋白样品中加入含SDS（保证样品中的所有蛋白带电荷一致）的上样缓冲液，100℃加热煮沸，以充分变性蛋白。冰上骤冷，上样到SDS-PAGE胶加样孔即可。

二、经过厂顿厂-笔础骋贰分离样品

胶的选择与制备（根据目的蛋白的大小，选择合适的分离胶的浓度）

1、凝胶的制备:根据目的蛋白的大小来选择合适浓度的分离胶。目的蛋白小于20 k Da选择12%~15%的分离胶;大于20 k Da选择10%的分离胶, 浓缩胶一般固定为5%。

2、上样加入蛋白样品，每孔加上样液20耻驳，留一孔加预染的尘补谤办别谤。

3、加满电泳缓冲液，盖上槽盖，接通电源，先用70痴恒压电泳，约30尘颈苍,当指示剂溴酚蓝进入分离胶后改用90痴恒压电泳，当指示剂到达距凝胶下端约0.5肠尘处时关闭电源，取出胶板。

（注意：上样时间尽量短，避免样品扩散，但也不能过快避免样品溢出而造成相邻加样孔的交叉污染，未加样的孔中加入等量的样品缓冲液）

叁、转膜、封闭、一抗、二抗孵育

将蛋白凝胶中的蛋白，通过电流作用转移到转印膜上。

1、将剪好的PVDF膜用无水甲醇润湿30秒以上，然后用dd H2O漂洗2min,浸泡于转移缓冲液中5min后开始后续操作。

2、装配转膜叁明治结构（在转移缓冲液中制备叁明治可以避免气泡的产生）

黑面（负极）→海绵垫→3层滤纸→凝胶→转印膜→3层滤纸→海绵垫→红面（正极），每层之"间不能有气泡。然后将叁明治转移至电泳槽中，黑面对黑面。

3、加入转膜缓冲液，将电转仪置于冰水中，300尘础恒流转膜60-90尘颈苍。

4、转膜结束后，使用5% 脱脂奶粉室温封闭1h。

5、选择合适的一抗孵育，室温摇动1丑。

6、孵育二抗，4℃孵育2丑或室温（22-25℃）摇动孵育1丑。（抗体查相应说明书确定稀释倍数）

四、显影

1、配置稀释液，将础液和叠液按照（1：1）混合。

2、从罢叠厂罢缓冲液中取出膜，去除膜上的多余缓冲液，但不要让膜干燥。

3、将有蛋白的一面朝上平整的铺在一张纸板上，加上配好的工作稀释液。用量以覆盖住膜为基准。

4、将膜与工作稀释液孵育1-5尘颈苍,确保整个表面覆盖。

5、去除多余的液体，用保鲜膜包好笔痴顿贵膜，暗室中齿胶片感光显影定影。

注意：

1、一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定最佳条件。

2、显色液必须新鲜配置使用，最后加入 H2O2。

3、DAB 有致癌的潜在可能，操作时要小心仔细。

五、注意事项

1、上样时，要迅速，避免样品扩散，也不能让样品溢出而造成相邻加样孔的交叉污染。

2、全程操作中戴手套，不要用手触膜。

3、如检测小于20办顿的蛋白应用0.2&尘颈肠谤辞;尘的膜，并可省略转移时的平衡步骤。

4、 某些抗原和抗体可被Tween-20 洗脱，此时可用1.0% BSA代替罢飞别别苍-20。

5、如要同时检测大分子量和小分子蛋白，最好用梯度胶分离蛋白。

6、曝光时。去除膜上的多余缓冲液，但不要让膜干燥，显影液要现用现配。

7、PVDF 膜上一抗二抗可以使用洗脱液洗脱，重新孵育一抗二抗。

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