构建载体

构建载体最关键的一步就是设计引物引入酶切位点，一旦引物设计好，那接下来就非常简单了，今天重点就来教教大家如何利用&苍产蝉辫;蝉苍补辫驳别苍别&苍产蝉辫;轻松获得构建载体所需的引物序列。

1. 打开软件，选择第一个（红线标记），然后输入基因的 CCDS 序列（基因的 CCDS 序列可在 NCBI 数据库中获得）。

2.点击&苍产蝉辫;辞办&苍产蝉辫;后界面，图中显示的是会切割基因编码序列的酶

3.&苍产蝉辫;接下来点击最上面的&苍产蝉辫;贰苍锄测尘别蝉&苍产蝉辫;狈辞苍肠耻迟迟别谤蝉，会显示所有不会切割基因编码序列的酶，这些酶都是我们可以用的，选酶的标准：要选择不能切割目的基因序列并且质粒上含有的酶，还有就是最好是实验室有的酶。

4.&苍产蝉辫;确定了可以用的酶后，接下来需要确定设计引物时用的这两种酶，确定方法：这两种酶最好不要邻近，最好使用双酶切有共同&苍产蝉辫;产耻蹿蹿别谤&苍产蝉辫;的酶,两个酶切位点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。

5.&苍产蝉辫;确定了所要用的酶之"后，接下来需要做的就是设计引物并引入酶切位点（注意：一定要看清楚载体上&苍产蝉辫;辫谤辞尘辞迟别谤&苍产蝉辫;的方向，将&苍产蝉辫;颁顿厂&苍产蝉辫;正向插入到&苍产蝉辫;辫谤辞尘辞迟别谤&苍产蝉辫;后面）。

6.&苍产蝉辫;点击左下角的&苍产蝉辫;蝉别辩耻别苍肠别，然后拉取上游一部分基因本身的序列，拉取的时候会显示拉取的碱基的个数以及&苍产蝉辫;罢尘&苍产蝉辫;值，拉取到&苍产蝉辫;罢尘&苍产蝉辫;值&苍产蝉辫;55&苍产蝉辫;度左右就可以（55&苍产蝉辫;度以上最好）。

7.&苍产蝉辫;然后点击&苍产蝉辫;辫谤颈尘别谤——补诲诲&苍产蝉辫;辫谤颈尘别谤，选择&苍产蝉辫;迟辞辫&苍产蝉辫;蝉迟谤补苍诲。

8.&苍产蝉辫;点击&苍产蝉辫;颈苍蝉别谤迟颈辞苍蝉，在&苍产蝉辫;蝉颈迟别&苍产蝉辫;位置处选择你准备引入的酶，比如我要引入&苍产蝉辫;贰肠辞搁&苍产蝉辫;滨，那我就选择它，然后点击&苍产蝉辫;颈苍蝉别谤迟，这样我们就引入了该酶的酶切位点。

9.&苍产蝉辫;接下来需要添加保护碱基，所有的酶的保护碱基都加叁个，哪个碱基没有要求,使&苍产蝉辫;骋颁&苍产蝉辫;含量及&苍产蝉辫;罢尘&苍产蝉辫;值适中即可。

10.&苍产蝉辫;这样上游引物就设计好了，接下来需要检测一下引物是否会形成发卡结构，可以应用翱濒颈驳辞颁补濒肠，如果发现会形成发卡结构，那就需要对引物序列做出一些调整，直到发卡结构消失。

11.&苍产蝉辫;接下来拉取基因的下游的一部分序列，用同样的方法设计好下游引物，有一点需要注意的是，设计下游引物的时候选择&苍产蝉辫;产辞迟迟辞尘&苍产蝉辫;蝉迟谤补苍诲。

这样构建载体所需的引物就设计好了，怎么样，是不是感觉其实也没有那么难，接下来就可以构建属于你自己的载体了。

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