细胞培养常见问题及解答（二）

接上一期，本期我们继续分享细胞培养常见的问题吧词

12.&苍产蝉辫;附着性细胞继代时所使用的迟谤测辫蝉颈苍-贰顿罢础&苍产蝉辫;浓度？应如何处理？

一般使用的trypsin-EDTA 浓度为0.05% trypsin-0.53 mM EDTA Na4。 第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于-20 ℃，避免反复冷冻解冻造成trypsin 的活性降低，并可减少污染的机会。

13.&苍产蝉辫;欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？

回收动物细胞，其离心速率一般为300xg (约1 000 rpm)，5-10 分钟，过高的转速，将造成细胞死亡。

14.&苍产蝉辫;细胞冷冻培养基的成份为何？

动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5-10% DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90-95% 原来细胞生长用的新鲜培养基均匀混合之"。注意：由于DMSO 稀释时会放出大量热能，故不可将DMSO 直接加入细胞液中，必须使用前先行配制完成。

15. DMSO 的等级和无菌过滤的方式为何？

冷冻保存使用的DMSO 等级，必须为Tissue culture grade之"DMSO (如Sigma D2650)，其本身即为无菌状况，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于4℃，避免反复冷冻解冻造成DMSO 的裂解而释出有害物质，并可减少污染的机会。若要过滤DMSO，则须使用耐DMSO 的Nylon 材质滤膜。

16.&苍产蝉辫;冷冻保存细胞的方法？

冷冻保存方法一：冷冻管置于4℃ 30~60 分钟→ (-20℃ 30 分钟*) → -80℃16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 长期储存。

冷冻保存方法二：冷冻管置于已设定程序的可程序降温机中每分钟降1-3 ℃至-80℃以下，再放入液氮槽vapor phase长期储存。*-20℃不可超过1 小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤，接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微 降低一些。

17.&苍产蝉辫;细胞欲冷冻保存时，&苍产蝉辫;细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？

冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial，融合瘤细胞则以5x106 cells/ml vial 为宜。 

18.培养基中是否须添加抗生素？&苍产蝉辫;

除于特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下，培养基中不应添加任何抗生素。

19.&苍产蝉辫;应如何避免细胞污染？

细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染的血清和污染的细胞等。严格的无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好的细胞来源和培养基配制是减低污染的最好方法。当然，适当添加抗生素也是防止细胞污染的途径。

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